Wolf K45E Manual do Utilizador descarregar pdf (Página 41)

Material und Methoden

_____________________________________________________________________________________

2.7 DNA-Sequenzierung

2.7.1 Beschreibung

Ziel der DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Basenfolge auf

Molekülebene. Hierzu stehen grundsätzlich zwei Methoden zur Verfügung:

Maxam und Gilbert entwickelten die chemische Sequenzierung, bei der die

DNA mit Chemikalien an bestimmten Stellen gespalten und so eine Reihe von

Fragmenten erzeugt wird [MAXAM U: GILBERT 1977]. Die enzymatische

Kettenabbruchmethode nach Sanger und Coulson beruht auf der Synthese von

DNA-Strängen, die an einem modifizierten Nukleotid abbricht [SANGER et al.

1977]. Diese ist in Abbildung 2.5 schematisch dargestellt.

Aufgrund ihrer hohen Genauigkeit und Verlässlichkeit ist die enzymatische

Kettenabbruchmethode heute das Verfahren der Wahl und findet auch in der

vorliegenden Arbeit Anwendung.

Am Anfang der Sequenzierung steht die Amplifikation des zu untersuchenden

DNA-Abschnittes mittels PCR. Hierbei unterscheiden sich die verwendeten

Primer (Forward- und Reverse-Primer) von denen der herkömmlichen PCR

durch das zusätzliche Vorhandensein einer spezifischen 5`-Sequenz von 20

Basenpaaren, an die bei der weiteren Sequenzreaktion ein fluoreszenz-

markierter Universal-Primer, der komplementär zu dieser Sequenz ist, bindet.

Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass für die zweite Sequenzreaktion

unabhängig von dem zu untersuchenden DNA-Abschnitt mit dazugehörigem

Primer der gleiche Sequenz-Primer benutzt werden kann.

Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl der

Vorwärts- als auch der Rückwärts-Strang sequenziert, welches die Modifikation

beider PCR-Primer erfordert. So erhält der Forward-PCR-Primer zur

Sequenzierung des kodierenden Stranges einen entsprechenden Abschnitt am

5`-Ende, an den der Forward-Primer der Sequenz-Reaktion (P 172) binden

kann. Analog trägt der Reverse-PCR-Primer zur Sequenzierung des nicht-

kodierenden Stranges ein 5`-Ende, die spezifisch für den Reverse-Primer der

Sequenz-Reaktion (M 13) ist.

Die in Tabelle 2.2 gezeigten Sequenzen der Sequenz-Primer sind so gewählt,

1 2 ... 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 ... 130 131

Sem comentários

Wolf K45E Manual do Utilizador Página 41