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Material und Methoden

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Nach dem Aushärten wird der Laufpuffer hergestellt. Dazu gibt man 120 ml TBE

10x ad 2 Liter Milli-Q-Wasser. Die Gelkammer wird in den Sequenzierer

eingehängt und der Laufpuffer eingefüllt.

Unmittelbar vor dem Beschicken der Geltaschen werden diese mit Puffer

gespült. Sind alle Proben aufgetragen, werden die Kathode und Anode

angeschlossen und die Sequenzierung gestartet. Die Trennung der Fragmente

erfolgt dann über 700 Minuten bei 1500 V, 38 mA, 34 W und 50°C. Die

Detektion der Fragmente mittels eines Rotlichtlasers wird computerunterstützt

aufgezeichnet.

2.7.4 Auswertung

Die Auswertung der Sequenzierung erfolgt mit Hilfe der AM V3.0 bzw. ALFwin

v1.10 Software, mit der sich die Rohdaten erfassen, analysieren und

prozessieren lassen. Die Fragmentreihen werden automatisch ineinander

integriert, sodass eine fortlaufende Sequenz entsteht.

Diese Sequenzen werden nun mit der Originalsequenz verglichen. Diese wurde

vorher mit einer Wildtyp-Sequenz abgeglichen, was zur Vermeidung

methodischer Fehler notwendig ist. Homozygote Mutationen lassen sich

folgendermaßen erkennen: Deletionen und Insertionen führen zu einer

Verschiebung des Leserasters, d.h. zu einem so genannten Frame-shift

gegenüber der Originalsequenz. Während bei einer Deletion eine oder mehrere

Basen in der Sequenz fehlen, kommen diese bei einer Insertion hinzu. Bei

Punktmutationen in Form eines Basenaustausches findet sich eine andere

Base als an entsprechender Stelle der Originalsequenz. Heterozygote

Mutationen zeigen ein anderes Erscheinungsbild, da hierbei zwei

unterschiedliche Allele vorliegen. Bei einer Mutation kommt es zu einer

Überlagerung zweier Kurven in der graphischen Darstellung, da die eine das

von der Mutter, die andere das vom Vater vererbte Allel zeigt. Im Falle einer

Deletion und Insertion ist ab der Stelle der Mutation das Leseraster

uneinheitlich verschoben, d.h., dass von da an zwei Kurven sichtbar sind. Bei

einem einfachen Basenaustausch kommt es lediglich an einer Stelle dieser

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