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Material und Methoden

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Tabelle 2.2

Oligonukleotid-Sequenz zur Primermodifikation

Name 5`-3`-Sequenz

P 172 (Forward) TAT TAT AGG GCG AAT TGG GT

M 13 (Reverse) TAT GTA AAA CGA CGG CCA GT

Für die Sequenzierung existieren vier Reaktionsgemische, von denen jedes

Desoxynucleotide (dNTP) und ein spezifisches Didesoxynucleotid (ddNTP)

enthält. Das Verhältnis der normalen dNTP zum ddNTP wird so gewählt, dass

im statistischen Mittel in jedem Reaktionsgemisch die Nukleotid-Kette überall

dort abgebrochen wird, wo sich im Normalfall ein Nukleotid, das dem gewählten

ddNTP entspricht, befände [HENSEN 1999]. Am Ende der Cycle-Reaktion

beinhaltet jeder Ansatz eine Anzahl an DNA-Fragmenten, an deren Ende sich

jeweils eines der zugefügten ddNTP befindet. Entsprechend der statistischen

Verteilung entspricht die Kollektion der Fragmentlängenunterschiede der Menge

des entsprechenden Nukleotids in der Basenfolge. Die Fragmente aller vier

Reaktionsgemische wird elektrophoretisch aufgetrennt. Aufgrund der

unterschiedlichen Laufgeschwindigkeit der Fragmente entsprechend ihrer

Länge kann man auf die Position der Basen im Matrizen-Strang schließen.

Während man in der klassischen Form die aufgetrennten Basen anfärbt (z.B.

DXWRUDGLRJUDSKLVFK PLW>.

6@G173RGHU >.

P]dNTP) und die Basensequenz

entgegen der Laufrichtung abliest (Abbildung 2.5), entfällt die Färbung bei

Laserstrahl

G A T C

Abbildung 2.6

Laserdetektion und computerunterstützte Datenverarbeitung

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